Метод Сэнгера | это... Что такое Метод Сэнгера? (original) (raw)

«Секвенирующая лестница», радиоавтограф геля

Метод Сэнгера — метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году[1], за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году.

Принцип метода

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:

• праймер — небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;
• небольшое количество радиоактивно меченного дезоксинуклеотида (например, [32P]-дАТФ), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции;
• смесь трёх дезоксинуклеотидов в оптимальных для протекания реакции концентрациях, четвёртый дезоксинуклеотид в более низкой концентрации и дидезоксипроизводное четвёртого нуклеотида.

У дидезоксирибонуклеотидов отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят радиоавтографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК[2][1].

Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в форме ДНК с помощью обратной транскрипции.

Современное состояние

Графическое представление результатов секвенирования ДНК

На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится на специальных приборах, секвенаторах. Использование дидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками с разными длинами волн испускания позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом в растворе, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки регистируются детектором флуоресценции. Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам. Секвенаторы такого типа могут «прочитывать» за один раз последовательности длиной 500—1000 нуклеотидов. Для сравнения, метод пиросеквенирования, разработанный в 1996 году, позволяет за один этап определить последовательность значительно меньшего числа нуклеотидов. Автоматизация значительно ускорила процесс секвенирования и позволила осуществить секвенирования целых геномов, включая геном человека[2].

Примечания

1. ↑ 1 2 Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci U S A.. — 1977. — В. 12. — Т. 74. — С. 5463-5467. — PMID 271968.
2. ↑ 1 2 Blackburn M. G. Chapter 5: Nucleic Acids in Biotechnology // Nucleic Acids in Chemistry And Biology. — Great Britain: Royal Society of Chemistry, 2006. — P. 168. — ISBN 0854046542

Литература

1. Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA. — 1977. — Т. 74. — С. 5463-5467.
2. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase // J Mol Biol. — 1975. — Т. 94. — С. 444-448.

См. также

• Секвенирование