Способ получения меченного тритием тромбоксана b3 — SU 1732513 (original) (raw)
Формула
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТРИТИЕМ ТРОМБОКСАНА B3, включающий инкубацию [3H] -тимнодоновой кислоты, L-адреналина и гемина с очищенными препаратами простагландин-H-синтетазы и тромбоксансинтетазы, экстракцию продукта органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, используют [3H] -тимнодоновую кислоту с концентрацией 10 - 100 мкМ в соотношении 13 130 нмоль на единицу активности простагландин-H-синтетазы, а препараты простагландин-H-синтетазы и тромбоксансинтетазы добавляют в реакционную смесь последовательно с интервалом 1 мин.
Описание
Изобретение относится к способам получения биологически активных соединений, меченных радиоактивными изотопами.
Тромбоксан (ТХ) А3 образуется в клетках млекопитающих наряду с ТХА2, но не обладает активностью ТХА2. В связи с этим важным клиническим показателем для определения состояния гемостаза и других функциональных систем организма является соотношение концентраций ТХА2 и ТХА3, которое на практике определяют как соотношение концентраций их стабильных метаболитов ТХВ2 и ТХВ3. [3Н] ТХВ3 и РИА-наборы для определения ТХВ3 советскими и зарубежными фирмами не выпускаются.
Сведения о способе получения меченного тритием тромбоксана В3 в патентной документации и научной литературе отсутствуют.
Структурные формулы тромбоксана В3 и его предшественников:
Тимнодоновая кислота
Тромбоксан А3
Тромбоксан В3
Целью изобретения является получение меченного тритием ТХВ3 с высокой молярной радиоактивностью.
Поставленная цель достигается выделением и частичной очисткой простагландин -Н-синтетазы (ПГ-Н-синтетазы) из везикулярных желез барана и ТХ-синтетазы из тробмоцитов человека, инкубацией [3H]-тимнодоновой кислоты (ТК) с концентрацией 10-100 мкМ с частично очищенным препаратом ПГ-Н-синтетазы при соотношении 0,1-1,1 мкмоль [3H] ТК на 1 мГ ПГ-Н-синтетазы (13-130 нмоль [3H] ТК на единицу активности ПГ-Н-синтетазы и препаратом частично очищенной ТХ-синтетазы с концентрацией 0,025-0,55 мг/мл в течение 25-40 мин при 25оС.
Описание методов выделения и очистки ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы и характеристики полученных препаратов ферментов приведены в примере.
За единицу активности (Е) ПГ-Н-синтетазы принимают количество фермента, способное превращать 1 мкмоль арахидоновой кислоты (АК) за 1 мин при 25оС в трис-буфере (рН 8).
На чертеже показана зависимость выхода [3H] ТХВ3 от концентрации тромбоксансинтетазы при 
0 (кривая 1) и 1 мин (кривая 2): А начальная концентрация [3H] ТК 25 мкМ, Б 75 мкМ; концентрация простагландин-Н-синтетазы 90 мкГ/мл, L-адреналина 2 мМ, гемина 2 мкМ; реакцию проводили в 20 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4) при 25оС.
Сущность изобретения заключается в использовании двух очищенных ферментов, не содержащих эндогенных полиненасыщенных жирных кислот, которые вводят в реакционную смесь, содержащую [3H] ТК.
Оптимизацию синтеза [3H] ТХВ3 проводят относительно выхода [3H] ТХВ 3, рассчитанного исходя из радиоактивности взятой в реакцию [3H] ТК.
Препарат ПГ-Н-синтетазы получают из везикулярных желез барана путем измельчения желез гомогенизатором, осаждения микросомальной фракции центрифугированием, солюбилизации мембранных белков неионным детергентом Tween-20, фракционирования на колонке с DEAE-целлюлозой.
Препарат ТХ-синтетазы получают из осажденных при фракционировании крови тромбоцитов человека путем разрушения клеток ультразвуком, выделения микросомальной фракции центрифугированием, солюбилизации неионнымм детергентом Triton Х-100, хроматографии на колонке с DEAE-целлюлозой.
Все эксперименты проводят в калийфосфатном буфере (рН 7,4). Реакцию начинают добавлением в реакционную смесь, содержащую [3H] ТК, препарата ПГ-Н-синтетазы или смеси препаратов ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы, а останавливают добавлением раствора лимонной кислоты (до рН 3). Время между добавлением к реакционной смеси ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы обозначают
Определены зависимости выхода [3H] ТХВ3 от концентрации препарата ТХ-синтетазы при двух начальных концентрациях [3H] ТК 25 и 75 мкМ и двух значениях 0 и 1 мин (см. чертеж). Как следует из представленных данных, выход [3H] ТХВ 3 при 1 мин выше, чем при 0. Соотношение выходов [3H] ТХВ3 при 1 мин и 0 пропорционально возрастает при увеличении концентрации ТХ-синтетазы и достигает значений 2,2-2,5 при начальных концентрациях [3H] ТК 25 и 75 мкМ. Максимальный выход [3H] ТХВ3 ( 1 мин) равен 17-18% при концентрации [3H] ТК 25 мкМ и 12,5-13% при 75 мкМ.
Определение молярной радиактивности [3H] ТХВ3, полученного при различных концентрациях исходной [3H] ТК и ТХ-синтетазы с помощью ВЭЖХ бромфенацилового эфира, меченного тритием тромбоксана, показывает, что ее значение не зависит от изменения перечисленных параметров и составляет 85-90% от молярной радиактивности соответствующей исходной жирной кислоты.
Обнаружен эффект существенного увеличения выхода [3H] ТХВ3 при последовательном добавлении ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы к реакционной смеси, содержащей [3H] ТК, через определенный промежуток времени причем оптимальное значение равно 1 мин. Из приведенных результатов видно, что соотношение выходов [3H] ТВХ3 при 1 мин и 0 при варьировании концентраций ТХ-синтетазы и [3H] ТК зависит только от концентрации препарата ТХ-синтетазы. Поэтому обнаруженный эффект может быть связан с неспецифической сорбцией исходной [3H] ТК на примесных белках, а также известным фактом ингибирования ТХ-синтетазы эйкозаполиеновыми кислотами (при начальной концентрации эйкозаполиеновой кислоты выше 100 мкМ ТХ-синтетазная активность заметно снижается). В случае > 0 и при избытке ПГ-Н-синтетазы оба эти ограничения становятся несущественными за счет быстрого превращения исходной [3H] ТК в лабильный промежуточный продукт, обладающий меньшей способностью сорбироваться на белках и не вызывающий ингибирования ТХ-синтетазы.
В этой связи возникают определенные требования к используемым для синтеза [3H] ТХВ3-препарата ферментам: максимальная степень очистки (или удельная активность) и отсутствие примесей полиненасыщенных жирных кислот (включая АК и ТК), которые могут приводить к ингибированию ТХ-синтетазы, а также к разбавлению их радиоактивномеченых аналогов и, как следствие, к снижению молярной радиоактивности конечного продукта.
Использование частично очищенных (по предлагаемым методикам) препаратов ПГ-Н-синтетазы и ТХ-синтетазы позволяет в отличие от использования цельных клеток, клеточных гомогенатов и мембранных препаратов максимально снизить или предотвратить полностью действие перечисленных отрицательных факторов.
Таким образом, инкубация [3H] ТК с концентрацией 10-100 мкМ с очищенным препаратом ПГ-Н-синтетазы (0,1-1,1 мкмоль [3H] ТК на 1 мГ ПГ-Н-синтетазы или 13-130 нмоль меченой тимнодоновой кислоты на 1Е ПГ-Н-синтетазы) и препаратом частично очищенной ТХ-синтетазы с концентрацией 0,22-0,55 мГ/мл в присутствии L-адреналина (2 мМ) и гемина (2 мкМ) в калийфосфатном буфере (рН 7,4) при 25оС в течение 25-40 мин приводит к образованию [3H] ТХВ3 с выходом 12-18%
П р и м е р. Получение меченного тритием ТХВ3.
1. Получение препарата ПГ-Н-синтетазы.
100 г везикулярных желез барана (-60оС) помещают в 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера (рН 8), содержащего 10 мМ Na2 
EDTA, 1 мМ диэтилдитиокарбамат (DEDTC) и 0,1% (w/v) Tween-20, измельчают до гомогенного состояния с помощью Waring Comm. Blender (10 раз по 15 с интервалом 30 с) и центрифугируют 30 мин при 4500 g. Полученный супернатант (около 230 мл) фильтруют через четыре слоя марли и центрифугируют 90 мин при 95 103 g. Осадок (микросомальная фракция) суспендируют в 20 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 2 мМ Na2 EDTA и 0,5 мМ DEDTC, с использование стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком, доводят объем суспензии буфером до 180 мл и повторно центрифугируют 90 мин при 95 103 g. Полученный осадок ресуспендируют в 20 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4) с 0,5 мМ EDTA и 0,1 мМ дитиотреитолом (DTT) (буфер А), добавляют 9 мл 10% (w/v) Tween-20, доводят объем до 60 мл буфером А и центрифугируют 120 мин при 95 103 g. Супернатант (около 50 мл), содержащий ПГ-Н-синтетазную активность, отбирают и наносят на колонку с DEAE-целлюлозной (2,5 х30 см), уравновешенную в буфере А, содержащем 0,1% (w/v) Lubrol РХ. Фракцию не связавшихся с DEAE-целлюлозой белков собирают и используют в дальнейшем в качестве частично очищенного препарата ПГ-Н-синтетазы. Все операции при выделении фермента проводят при температуре 4оС.
В результате приведенной процедуры получают 75 мл препарата ПГ-Н-синтетазы с концентрацией белка 0,9 мг/мл и специфической активностью 8,3 мкмоль арахидоновой кислоты в 1 мин на 1 мГ белка (25оС, 50 мМ трис-буфер, рН 8).
2. Получение препарата тромбоксансинтетазы.
К 60 г осажденных центрифугированием тромбоцитов человека (получены на Центральной станции переливания крови, Москва), которые хранили до использования при -60оС, добавляют 20 мл 20 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 10 мМ Na2 EDTA, 0,1 мМ дитиотреитол и 1,15% KCl (буфер Б), гомогенизируют в Waring Comm. Blender (10 раз по 30 с промежутками в 30 с), обрабатывают ультразвуком 20 раз по 5 с с промежутками в 25 с (22 Гц, амплитуда 14-16 единиц между пиками). Полученный таким образом клеточный гомогенат (около 250 мл) центрифугируют 25 мин при 4000 g, после чего супернатант (около 180 мл) рецентрифугируют 90 мин при 90 103 g. Осадок (микросомальная фракция) суспендируют в буфере Б, доводят объем до 180 мл и центрифугируют 90 мин при 90 103 g. Полученные в осадке микросомы ресуспендируют в 20 мМ калийфосфатном буфере, содержащем 1 мМ Na2 EDTA, 0,5 мМ DTT, 10% глицерина и 1% Lubrol РХ, доводят объем до 90 мл, выдерживают 1 ч при + 4оС и центрифугируют 120 мин при 90 103 g. К 80 мл полученного супернатанта (фракция солюбилизированного детергентом фермента) добавляют 16 мл 0,2 М калийфосфатного буфера и 25-30 мл DEAE- целлюлозы "Whatman", уравновешенной в 50 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 1 мМ Na2 EDTA, 0,1 мМ DTT, 10% (w/v) глицерина (буфер В), и выдерживают 30 мин при 4оС с перемешиванием. Не связавшуюся с DEAE-целлюлозой фракцию, содержащую тромбоксансинтетазную активность, отделяют центрифугированием (15 мин при 3500 g). Оставшийся в осадке гель повторно суспендируют в 25-30 мл буфера В, выдерживают 10 мин при 4оС и центрифугируют.
В результате получают 75 мл препарата тромбоксансинтетазы с концентрацией белка 1,09 мг/мл и специфической активностью 0,13 мкмоль ПГН2 в 1 мин на 1 мг белка (25оС, 20 мМ калийфосфатный буфер, рН 7,4).
3. Получение [3H] ТХВ3.
К раствору 2,2 ГБк (0,25 мкмоль) [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 19 (n)-3H] тимнодоновой кислоты с молярной радиоактивностью 9,25 ПБк/моль в 100 мкл этилового спирта добавляют 0,5 мл 0,2 М калийфосфатного буфера (рН 7,4), 100 мкл 100 мМ раствора L-адреналина, 100 мкл 100 мкМ раствора гемина, предынкубируют реакционную смесь 5 мин при 25оС и добавляют 1 мл выдержанного при 25оС и препарата ПГ-Н-синтетазы. Через 1 мин добавляют 5 мл проинкубированного при 25оС препарата ТХ-синтетазы и продолжают инкубацию в течение 30 мин при той же температуре. Реакционную смесь подкисляют 2 М раствором лимонной кислоты (до рН 3) и экстрагируют продукты реакции этилацетатом (3х30 мл). При этом в экстракте оказывается не менее 90% от исходной радиоактивности. Экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют, упаривают и растворяют в метаноле. Выход [3H] ТХВ3 определяют с помощью ТСХ продуктов реакции в системе растворителей А (хлороформ метанолуксусная кислота 90:9:1, v/v/v). Распределение радиоактивных продуктов по пластинке определяют с помощью радиохроматосканера. Очистку [3H] ТХВ3 осуществляют с помощью препаративной ТСХ на силикагельных пластинках "Силуфол" (ЧСФР) в системе растворителей А. [3H] ТХВ3 элюируют с пластинки этилацетатом (3х3 мл), затем растворитель упаривают и вещество растворяют в 10 мл этанола.
Получают 0,37 ГБк (17% ) [3H] ТХВ3 с молярной радиоактивностью 8,25 ПБк/моль и радиохимической чистотой 98%
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения тромбоксана B3 Инкубируют [3H] -тимнодоновую кислоту (ТК) с препаратом простагландин-Н-синтетазы (ПГН) при соотношении 0,3 3,3 мкмоль [3H] ТК на 1 мг ПГ-Н-синтетазы в течение не более 4 мин, после чего добавляют препарат частично очищенной тромбоксансинтетазы и инкубируют 25 40 мин при 25°С. 1 ил.
Рисунки
Заявка
4859979/14, 20.08.1990
Институт молекулярной генетики АН СССР
Лазуркина Т. Ю, Мясоедов М. Ф, Нагаев И. Ю, Шевченко В. П, Шрам С. И
МПК / Метки
МПК: A61K 38/00
Метки: меченного, тритием, тромбоксана
Опубликовано: 09.02.1995