Pfu DNA polymerase (original) (raw)
La polimerasa de ADN Pfu (PfuPol) es una enzima encontrada en la arqueobacteria hipertermófila Pyrococcus furiosus, donde funciona copiando el ADN del organismo durante la división celular. En el laboratorio de biología molecular, PfuPol suele utilizarse para amplificar ADN en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde la enzima realiza la función central de copiar una nueva hebra de ADN en cada paso de extensión.
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| dbo:abstract | Die Pfu-Polymerase ist ein Enzym aus dem thermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus. Es ist eine thermostabile DNA-Polymerase mit einer Korrekturlese (engl. proof-reading)-Funktion, die in der biochemischen Laborarbeit bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wird. Die DNA-Synthese erfolgt wie bei allen DNA-Polymerasen in 5'→3'-Richtung. Die Korrekturlesefunktion der Pfu-Polymerase (3'→5' Exonukleaseaktivität) sorgt dafür, dass der neu synthetisierte DNA Strang fortlaufend auf Fehlpaarungen überprüft wird, welche umgehend mit dem Ausbau des fehlerhaften und dem Einbau des korrekt basenpaarenden Nukleotids korrigiert werden. Die Pfu kommt in der Molekularbiologie hauptsächlich bei denjenigen PCR-Reaktionen zum Einsatz, die sequenzexakte DNA-Amplifikate liefern müssen. Für die übrigen PCR-Operationen ist die wesentlich günstigere und schnellere, dafür weniger akkurate Taq-Polymerase ausreichend.Anders als Taq-Polymerasen, erzeugt die Pfu keine 3′-Überhänge aus Adenosylresten, sondern liefert "glatte Enden" (engl. blunt ends). Damit ist das Klonieren von blunt end geschnittener DNA möglich. Die read-ahead-Funktion der Pfu-Polymerase ist gekennzeichnet durch das Vorauserkennen von Uracil in DNA-Strängen. Uracil kann durch Desaminierung von Cytosin entstehen und würde eine Basenpaarung mit Adenin zur Folge haben (A:U statt G:C) – sie kommt normalerweise nicht in DNA vor. Die spezifische Funktion der Pfu-Polymerase ist nun, bei Erkennen von Uracil, die DNA-Synthese zu stoppen. Andere Reparaturenzyme übernehmen dann die Korrektur der DNA. Uracil bzw. dUTP führt bei einer Verwendung der Pfu-Polymerase in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) zu einer geminderten Syntheserate, was als dUTP-poisoning (dUTP-Vergiftung) bezeichnet wird. Dagegen werden zugesetzt. Alternative thermostabile DNA-Polymerasen, die in der PCR eingesetzt werden, sind beispielsweise die Pwo-Polymerase (mit proof-reading) und die Taq-Polymerase (ohne proof-reading). (de) La polimerasa de ADN Pfu (PfuPol) es una enzima encontrada en la arqueobacteria hipertermófila Pyrococcus furiosus, donde funciona copiando el ADN del organismo durante la división celular. En el laboratorio de biología molecular, PfuPol suele utilizarse para amplificar ADN en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde la enzima realiza la función central de copiar una nueva hebra de ADN en cada paso de extensión. (es) L'ADN polymérase Pfu, souvent appelée Pfu polymérase par anglicisme, est l'ADN polymérase de Pyrococcus furiosus, une archée hyperthermophile. En tant qu'ADN polymérase, cette nucléotidyltransférase a pour fonction de répliquer l'ADN au cours de la division cellulaire. La Pfu polymérase est utilisée au laboratoire pour l'amplification PCR de l'ADN, fonction pour laquelle elle présente plusieurs avantages par rapport à la Taq polymérase de Thermus aquaticus, une bactérie thermophile : elle est thermiquement plus stable, et surtout elle possède une activité exonucléase 3' vers 5' permettant d'éliminer les erreurs d'insertion de bases nucléiques au cours de la réplication, de sorte que la PCR par Pfu polymérase est plus fiable que celle réalisée à l'aide de la Taq polymérase. La Pfu polymérase disponible commercialement génère un taux d'erreur de 1 pour 1,3 million de paires de bases et peut produire environ 2,6 % d'ADN muté lorsqu'elle est utilisée en PCR. Elle est cependant plus lente que la Taq polymérase, requérant typiquement une à deux minutes par cycle pour amplifier 1 kb d'ADN à 72 °C. (fr) Pfu DNA polymerase is an enzyme found in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, where it functions to copy the organism's DNA during cell division. In the laboratory setting, Pfu is used to amplify DNA in the polymerase chain reaction (PCR), where the enzyme serves the central function of copying a new strand of DNA during each extension step. It is a family B DNA polymerase. It has an RNase H-like 3'-5' exonuclease domain, typical of B-family polymerase such as DNA polymerase II. (en) Pfu DNA polimerase merupakan salah satu jenis enzim yang digunakan dalam reaksi PCR (polymerase chain reaction). PCR ini banyak digunakan dalam berbagai penelitian dibidang molekuler untuk memperbanyak sekuen DNA. Enzim Pfu DNA polimerase mampu memperpanjang rantai DNA dalam suatu siklus. Sumber utama enzim ini adalah Pyrococcus furiosus. Keunggulan utamanya dibandingkan dengan enzim DNA polimerase lainnya ialah waktu paruhnya yang sangat lama dan adanya mekanisme perbaikan rantai DNA yang salah (proofreading). Selain itu, enzim ini bersifat termostabil atau bersifat tahan suhu tinggi. Mekanisme proofreading-nya adalah 3'-5' eksonuklease. Melalui mekanisme proofreading, suatu kesalahan penambahan basa DNA saat amplifikasi dapat diperbaiki. Aktivitas proofreading ini memiliki keakuratan yang sangat tinggi sehingga enzim ini sering kali digunakan dalam reaksi pemanjangan primer, kloning, dan amplifikasi rantai DNA ujung tumpul (blunt end). (in) A ADN polimerase Pfu, também chamada Pfu DNA polimerase ou Pfu polimerase é uma ADN polimerase da arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus. A sua função no microorganismo desta nucleotidiltransferase é a de replicar o seu ADN durante a divisão celular. A Pfu polimerase utiliza-se no laboratório para amplificar o ADN na reação em cadeia da polimerase (PCR), função para a qual apresenta várias vantagens em relação à enzima tradicionalmente usando Taq polimerase da bactéria termófilas Thermus aquaticus, uma vez que é termicamente mais estável e, acima de tudo, tem uma atividade 3'-5' que permite eliminar os erros de inserção das bases durante a replicação (atividade de ). Consequentemente, a PCR realizada com a Pfu polimerase é mais confiável do que a realizada com a Taq polimerase. A Pfu polimerase disponível comercialmente gera uma taxa de erro de 1 por 1,3 milhões de pares de bases e pode produzir 2,6% de produtos mutados na PCR. Porém, é mais lenta que a Taq polimerase, uma vez que leva entre 1 a 2 minutos por ciclo para amplificar 1 kb de ADN a 72°C. (pt) |
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