Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к субъединице гонадотропных гормонов человека (original) (raw)
Текст
союз советскихСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 51)5 С 12 М А 61 К 39/39 ТЕЛЬСТ ТОРСНОМ ИВИРУЕМЫХБ, ИСПОЛЬОНАЛЬНЫХАДОТРОП-с к гибриыть ис пользован онадотроуют ме: всме(ПАФ) реп ден ренориреимт с муе ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТпО изоБРетениям и ОТКРытияпРи Гннт сссР(71) Научно-исследовательский инсти.тут морфологии человека АМН СССР(56) Огйцг 1 М. е а 1. РЬуя 1 о 1 ок 1 са 1яйц 61 ея оГ Ьцшап СЬог 1 оп 1 с Сопас 1 ойгор 1 п (ЬСС), аЬСС апд ВЬСС ая шеаяцгей Ъу яресИ 1 с вопос 1 опа 1 1 тпацпо-гад 1 ошеСг 1 с Аяяауя. Епйосг 1 по 1 оду,ч. 120, М 2, 1987, р,549-558.(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬКЛЕТОК ЖИВОТНЫХ МББ.М 11 БСШЛ 3ЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКАНТИТЕЛ К Ы-СУБЪЕДИНИЦЕ ГОННЫХ ГОРМОНОВ ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относитсядомной технологии и может Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормоновв биологических жидкостях организма,Цель изобретения - получение штам.ма гибридных культивируемых клеток,продуцирующих моноклональные антитела (монАТ), специфичные к о-хорионическому, -лютеинизирующему, с"фолликулостимулирующему и ф(-тиреотропному гонадотропинам человека,Штамм получают следующим образом,801555360 А 1 пользовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормонов в биологических жидкостях организма. Цель изобретения - получениештамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклонольныеантитела, специфичные к Ы-хорионическому, с(-лютеинизирующему, о-фолликулостимулирующему и о-тиреотропному гонадотропинам человека. Штаммполучен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии Х 63.А 8.653с клетками селезенки мьппи ВА 1.В/с,иммунизированной хорионическим гонадотропином человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) 9 235 Р, Продуцирует моноклональные антитела 1 яСкласса в количестве 10 мкг/мл культуральной среды и 7 мг/мл асцитической жидкости, титры антител 1:3000и 2 х 10 соответственно, определенныев твердофазном ИФА,В качестве антигена испрепарат хорионического гпина человека (ХГЧ)Мышей линии ВАЯВ/с иммунизивнутрибрюшинно го следующей сх1-й день - 500 ед, препарата вси с полным абъювантом Фрейндана 14 и 28-й дни - по 250 ед,та с ПАФ реиммунизация на 562500 ед, препарата ХГЧ в забуфком физиологическом растворе хлда натрия. Через 72-96 ч посленизации у мьппи стерильно удалялезенку и готовят суспензию спл1555360цитов. Клетки селезенки мьппи ВА 1.В/симмунизированной препаратом ХГЧ, сливают (гибридизуют) с клетками мыши -ной миеломы Х 63.Ад 8,653. Сливающийагент ПЭГ(50% раствор). Селек 5цию проводят на среде НАТ, два клонирования методом лимитирующего разведения (1.клетка на 3 лунки), 100%позитивных клонов.1 ОПолученный штамм гибридных клетокобозначен 085 . Штамм хранится в%Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоноч.ных Всесоюзной коллекции клеточныхкультур под номером ВСКК (П) В 235 Эи характеризуется следующими признаками.Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания. Среда ДМЕМ+ 20+10% фетальной сыворотки крупногорогатого скота (Рсэ) температура приокультивировании 37 С, газовая фазавоздух +5% СО, Способ культивирования - в пластиковых флаконах на 50-." 25250 мл, посевная доза 500.000 клеток/мл, кратность рассева 1:2времясубкультивирования 3-4 дня,В организме животного - .мьппь ВАЯВ/собработанная пристаном (0,5 мл.в/бр.за 5-40 дней до инокуляции), доза,инокуляции 3-8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней,Характеристика продуцируемого продукта, Штамм гибридных клеток продуцирует монАТ 1 яС класса, направленныепротив,Ы-ХГЧ с-ЛГ, о(-ФСГ и с(-ТТГчеловека. Концентрация полезного продукта (монАТ против Ы-ХГЧ. с-ЛГ,Я-ФСГ и ТТГ человека) в культуральной среде около 10 мкл/мл,.в асцити"ческой жидкости - около 7 мг/мл, титры данных антител при определении спомощью твердофазного иммуноферментного метода 1:3000 в культуральной 45среде, 2 х 10 - в асцитической жидкости, при концентрации антигена при нанесении на пластинки 30 ед/мл официнального препарата ХГЧ.Определение антител проводят имму 50 ,нофлуоресцентными и радиоиммунологическими методами. Продукция монАТ стабильна по крайней. мере в течение 35 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома пере.вивается на мьппах. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены Способ криоконсервации. 4 х 10клеток в ДМЕМ+10% Гса+10% ЭМБО, замораживание в пенопластовой коробке,Огпри -70 С, жизнеспособность клетокпосле размораживания 70-90% (оценкажизнеспособности по исключению клетками трипанового синего после 24 чкультивирования),П р и м е р 1. При использованиигибридомы получены специфические кс 1-ХГЧ, -ЛГ; Ы-ФСГ и И-ТТГ человека монАТ путем выделения их из асци.тической жидкости мьппи. Иэ 1 мл ас-.цитической жидкости с помощью высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией наклонках с ДЕАЕцеллюлозой. вьщеляют 7,5 мг монАТ к анти- с(-ХГЧ1Ы-ЛГ, Ы-ФСГ и Ы-ТТГ человека,Контроль на специфичность монАТпроводят в системе твердофазного иммуноферментного анализа. МонАТ реагируют с Ы-ХГЧ, цельной молекулойХГЧ (официальный препарат ), ЛГ, ФСГи ТТГ человека, не реагируют с ЛГсвиньи, коровы, лошади, ФСГ-свиньии коровы и ХГ-лошади. П р и м е р 2, Продуцируемыештаммом монАТ используют для разработки твердофазной системы иммуноферментного анализа для определенияХГЧ и ЛГЧ в биологических жидкостяхорганизма, На пластинках адсорбируютмонАТ против р-ХГЧ или и-ЛГЧ(О мкг/мл), инкубируют при 4 С втечение 12-17 ч. Отмывают несвязавшиеся с пластиком монАТ буфером РВЯ3 раза; инкубируют пластинки при.ком- .натной температуре в течение 1 чповторно отмывают 3 раза буфером РВЯс твином(0,5 мл на 1 л - 0,05%).Добавляют исследуемую пробу биологической жидкости (сыворотка крови, моча). Инкубируют 1 ч при 37 С, отмывают 3 раза смесью РВЯ - твин добавляют конъюгированные с пероксида"зой монАТ (концентрация 4 мг/мл) врабочем разведении (1:1600) в РВЗтвин, Инкубируют 1 ч при 37 С,отмывают 5 раз смесью РВБ - твин и 3 раза холодной водопроводной во. -дой, добавляют субстрат, 4 мкл 33% -.НОна 20 мин при комнатной температуре. Останавливают реакцию добавлением 10%-.ного раствора НБО и учитывают результат путем измерения оптической плотности при 492 нм,Заказ 538 Тираж 495ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР113035, Иосква, %-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 5 155536Использование штамма гибридомы .позволяет получать монАТ реагирую-, щие с ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в разве-, дении 1 мкг/мл и проводить определения уровня гонадотропицх гормонов вбиологических жидкостях организма с помощью иммунологических методов,О 6Формула изобретенияШтамм гибридных культивируемых клеток животных Мцз.шцзсц 1 цз ВСКК (П) Ф 2350 используемый для получеч ния моноклональнцх антител к а(-субь" единице гонадотропных гормонов человека,
Заявка
4441161, 13.06.1988
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА АМН СССР
ФИДЛЕР РАЙМУНД, ВЕРБИЦКИЙ МИХАИЛ ШНЕЕРОВИЧ, ПАПАЗОВ ИВАН ПЕТРОВИЧ
МПК / Метки
МПК: A61K 39/395, C12N 5/00
Метки: антител, гибридных, гонадотропных, гормонов, животных, используемый, клеток, культивируемых, мusсulus, моноклональных, субъединице, человека, штамм
Опубликовано: 07.04.1990